Pengukuran dengan Metode Spektrofluorometri

Advertisement
Metode spektrofluorometri adalah suatu metode pengukuran berdasarkan sinar yang berfluoresensi. Fluoresensi adalah gejala dari suatu molekul setelah radiasi cahaya, melepas kembali radiasi tadi dengan panjang gelombang yang lebih panjang. Fluroresensi akan nampak jelas apabila penyerapan sinar pada daerah ultraviolet dan melepaskannya dalam daerah gelombang nampak. 

Kebanyakan bahan organik ada dalam keadaan dasar (S0 V0), pada suhu kamar. Penyerapan energy sinar (photon) meningkatkan electron dalam molekul organik ke tingkat yang lebih tinggi (S1 V1 dan seterusnya) dalamwaktu kurang dari 10-15 detik. Setelah penyerapan, tenaga berkurang karena benturan (sebagai panas) menyebabkan tenaga pada molekul yang terangsang turun lagi dengan cepat pada getaran terendah dalam keadaan masih terstimulus (S1 V0). Tenaga yang dilepaskan dari molekul yang kembali ke tingkat dasar dalam waktu cepat, kurang dari 10-8 detik akan meningkat intensitas fluoresensi, sebagai petunjuk adanya pergeseran stokes. Meskipun banyak senyawa organik menyerap pada daerah gelombang ultra violet dan nampak, hanya beberapa saja yang berfluoresensi. 

Apabila struktur molekul bahan organik dapat dipakaiuntuk memperkirakan spectrum serapannya, hal yang sama tidak dipakai untuk memperkirakan senyawa apa yang berfluorosensi. Tetapi ada sedikit petunjuk bahwa senyawa alifatis cenderung memecah sinar dan tidak berfluoresensi, senyawa aromatis yang berisi electron tertentu yang tidak ditempat normalnya akan berfluoresensi.

Radiasi yang dilepaskan dapat berkisar pada beberapa panjang gelombang, maka spectrum fluoresensi berupa kumpulan atau pita spectrum. Spektrum fluoresensi biasanya tidak tergantung panjang gelombang radiasi yang terserap. Spectrum fluoresensi hanya dapat memberikan informasi pada saat kurang dari 10-8 detik.

Intensitas dapat berkurang antara 10 – 15 % apabila suhu sampel menurun dari 30oC menjadi 20oC, maka diperlukan pengatur suhu agar pengukuran dapat lebih tepat. 

Peralatan pokok spektrofluorometer adalah :

Sumber spectrum yang kontinyu misalnya dari jenis lampu merkuri atau xenon. 
Monokromator (M1) untuk menyinari sampel dengan panjang gelombang tertentu. 
Monokromator kedua (M2) yang pada iradiasi konstan dapat dipakai menentukan panjang gelombang spectrum fluoresensi sampel. 
Detector berupa fotosel yang sangat peka misalnya fotomultiplier merah untuk panjang gelombang lebih besar dari pada 500 nm. 
Amplifier untuk mengandakan radiasi dan meneruskan ke pembacaan. 

Penggunaan mikrosel dapat dikurangi efek prafilter dan pascafilter pada larutan yang pekat. Absorpsi prafilter mengurangi radiasi yang sampai pada sampel yang terjauh dari sumber sinar dan pasca filter terjadi karena pengurangan radiasi fluoresensi yang lepas dari kuvet. Selain penyinaran dengan arah 90oC dapat dilakukan front-face illumination dengan arah 45o sehingga efek filtrasi dapat dicegah, namun biasanya kurang peka dibanding penyinaran 90o.

Keuntungan Menggunakan Spektrofluorometer

Dapat untuk mengukur konsentrasi sampel yang rendah (pikogram). Kepekaan fluorimetri dapat diatur dengan penguatan aliran listrik yang terbentuk dari jalinan fotosel. Spektroflurorimetri sangat mungkin menggunakan spectrum pilihan yang lebih luas karena geseran Stokes dan adanya dua monokhromator yang dapat dipakai, atau untuk spectrum yang mengenai sampel dan yang lain untuk spectrum fluroresensi yang timbul. Untuk fluorimetri tidak diperlukan kuvet pembanding (referensi) tapi kurva kalibrasi tetap harus dibuat.

Kelemahan Spektrofluorimetri 

Kelemahan yaitu ketergantungan pada keadaan lingkungan dan tidak ada pegangan senyawa apa yang akan berfluoresensi. Masalah lain dalam fluorimetri adalah penghapusan (quenching) yaitu energi yang seharusnya dilepas sebagai sinar fluoresensi terserap oleh molekul lain. Atau sebaliknya bahan-bahan diluar sampel seperti bahan pencuci (detergent), minyak pelumas, kertas saring atau kertas lap dapat mempengaruhi pengukuran fluorimeter karena dapat melepas sinar fluoresensi sendiri.

Teknik flurometri dapat diperluas untuk mendeteksi adanya perubahan kimiawi (chemical modification) seperti oksidasi, reduksi, hidrolisa, polimerisasi dan pembekuan. Misalnya morfin dapat diukur dengan mengoksidasinya menjadi pseudomorfin yang berfluoresensi, tertrasiklin kalau bergabung dengan kalsium berfluoresensi.

Spektroflurometri dapat digunakan untuk :

Analisa kualitatif , Perbandingan spectrum fluoresensi dapat membantu pengenalan senyawa. 
Analisa kuantitatif, Pengukuran dapat dilakukan pada kadar yang sangat rendah dengan ketepatan, keterulangan, dan kepekaan tinggi. Misalnya pengukuran kadar vitamin E. Bila panjang gelombang emisi dan eksitasi telah dipilih, makandapat dibuat hubungan antara intensitas fluoresensi dengan konsentrasi senyawa. Intensitas fluoresensi tergantung dari tingkat konsentrasi senyawa. Hubungan tersebut berupa garis lurus (linier) pada konsentrasi sangat rendah. Apabila kadarnya terlalu tinggi, larutan tersebut tidak linier lagi karena akan menyerap sebagian sinar eksitasi. 

Uji enzim dan analisa kinetika, Enzim hidrolase dapat dengan mudah diukur melalui kecepatan munculnya senyawa yang berflurosensi pada 450 nm. 
Reaksi NAD+ dan NADP+ , Enzim dapat dilihat dalam keadaan aslinya (invitro), misalnya kadar substrat enzim atau kofaktor yang sangat rendah. 
Uji struktur protein. Beberapa jenis protein mengandung khromofore yang berfluoresensi (misalnya tirosin dan FAD), maka protein juga berfluoresensi. 
Penunjuk fluoresensi dan uji struktur membrane, Sifat fluoresensi molekul berubah oleh gerak maupun arah gerak (polaritas) lingkungannya, maka deteksi senyawa fluoresensi dapat memberikan petunjuk lingkungannya. 
Mikrosspektrofluorimetri. Gabungan antara spektrofluorimetri dengan mikroskop dapat dipakai untuk menunjukkan tempat senyawa berfluoresensi pada sel yang mengikat cat fluoresensi. 

Sumber referensi Sudarmadji, S., 1996, Teknik Analisa Biokimia, Penerbit Liberty, Yogyakarta.








,


ARTIKEL YANG BERKAITAN