1. Preparasi sel/jaringan
Darah yang
digunakan leukositnya, eritrosit dilisiskan dan dibuang. Secepatnya diekstraksi
untuk mendapat hasil optimal,leukosit
disimpan sebaiknya pada suhu 4 derajat C, penyimpanan yang lama (> 1
bulan) akan menurunkan hasil ekstraksi, volume 3 – 5 ml whole blood.
Jaringan yang diambil secepatnya diekstraksi. Penyimpanan jaringan pada suhu -80 derajat. Jaringan yang disimpan
dalam paraffin blok sulit untuk diekstraksi.
2.
Lisis membran sel/organella (nukleus)
Senyawa yang digunakan
untuk melisiskan membran yaitu Phenol : senyawa yang sangat kuat untuk melisiskan membran, tetapi
toksik. Selain itu digunakan Guanidine isothicyanate : tidak toksik, digunakan sebagai pengganti
phenol
3. Denaturasi senyawa organik
Untuk medenaturisasi
protein yang ada digunakan senyawa Kloroform : paling
banyak digunakan karena prosedur sederhana, murah, mudah diperoleh. Selain kloroform juga digunakan Proteinase K untuk denaturasi protein tetapi perlu inkubasi.
4. Presipitasi DNA
Digunakan senyawa Isopropanol dengan volume 1:1, atau Ethanol absolut dan sodium asetat 1:10
5. Pencucian/washing
Pencucian sisa senyawa
mengunakan Ethanol
70%
Metode-metode yang
digunakan dalam ekstraksi DNA
1. Phenol:chloroform
Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini
ditinggalkan, karena sifat toksik phenol
2. Salting Out
Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl
6 M), untuk medenaturisasi protein
menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein
3. Guanidine isothiocyanate
Metode ini lebih cepat dibanding dua metode
sebelumnya, Thiocyanate bersifat
toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein.
4. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan
perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang.
Pengukuran kualitas DNA
Kualitas DNA yaitu utuh,
tidak putus-putus, konsentrasinya tinggi dan tidak banyak terkontaminasi
protein. Menentukan kualitas DNA dengan Spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm (protein 280 nm; DNA
baik apabila pengukuran pada 260:280 = 1,7 – 1,9). Satu OD = 50 ng DNA. Dilihat dengan
elektroforesis, band yang tebal secara kualitatif menunjukkan DNA yang bagus
Penyimpanan DNA
DNA disimpan dalam TE buffer
(tris-hydroxymethyl amino methana – EDTA), Disimpan – 80 derajat bisa tahan bertahun-tahun. Untuk kerja, sebaiknya
disiapkan DNA yang sudah diencerkan menjadi 100 ng/mikroliter. Freezing – thawing
berulang dapat meyebabkan kerusakan DNA.
Judul: Prinsip Kerja dari Ekstraksi DNA
Rating: 100% based on 99998 ratings. 5 user reviews.
Ditulis Oleh 10:41 PM
Rating: 100% based on 99998 ratings. 5 user reviews.
Ditulis Oleh 10:41 PM
0 komentar:
Post a Comment
Silahkan Tinggalkan Komentar atau Pertanyaan Anda : JANGAN komentar yang tidak berhubungan dengan materi dan JANGAN tinggalkan link web karena dianggap spam. Blog ini dofollow sehingga anda akan mendapatkan Backlink gratis.