Prinsip Kerja dari Ekstraksi DNA

Advertisement
1. Preparasi sel/jaringan
Darah  yang digunakan leukositnya, eritrosit dilisiskan dan dibuang. Secepatnya diekstraksi untuk mendapat hasil optimal,leukosit disimpan sebaiknya pada suhu 4 derajat C, penyimpanan yang lama (> 1 bulan) akan menurunkan hasil ekstraksi, volume 3 – 5 ml whole blood.
Jaringan yang diambil secepatnya diekstraksi. Penyimpanan jaringan  pada suhu -80 derajat. Jaringan yang disimpan dalam paraffin blok sulit untuk diekstraksi.

 2. Lisis membran sel/organella (nukleus)
Senyawa yang digunakan untuk melisiskan membran yaitu  Phenol : senyawa yang sangat kuat untuk melisiskan membran, tetapi toksik. Selain itu digunakan Guanidine isothicyanate : tidak toksik, digunakan sebagai pengganti phenol

3. Denaturasi senyawa organik
Untuk medenaturisasi protein yang ada digunakan senyawa Kloroform : paling banyak digunakan karena prosedur sederhana, murah, mudah diperoleh. Selain kloroform juga digunakan Proteinase K untuk  denaturasi protein tetapi  perlu inkubasi.

4. Presipitasi DNA
Digunakan senyawa Isopropanol dengan volume 1:1, atau Ethanol absolut dan sodium asetat 1:10

5. Pencucian/washing
Pencucian sisa senyawa mengunakan  Ethanol 70%
Metode-metode yang digunakan dalam ekstraksi  DNA
1. Phenol:chloroform
Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol
2. Salting Out
Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein
3. Guanidine isothiocyanate
Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnyaThiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein.
4. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang.  

Pengukuran kualitas DNA
Kualitas DNA yaitu utuh, tidak putus-putus, konsentrasinya tinggi dan tidak banyak terkontaminasi protein.  Menentukan kualitas DNA dengan Spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm (protein 280 nm; DNA baik apabila pengukuran pada 260:280 = 1,7 – 1,9). Satu OD = 50 ng DNA. Dilihat dengan elektroforesis, band yang tebal secara kualitatif menunjukkan DNA yang bagus

Penyimpanan DNA
DNA disimpan dalam TE buffer (tris-hydroxymethyl amino methana – EDTA), Disimpan – 80 derajat bisa tahan bertahun-tahun. Untuk kerja, sebaiknya disiapkan DNA yang sudah diencerkan menjadi 100 ng/mikroliter.  Freezing – thawing berulang dapat meyebabkan kerusakan DNA.

ARTIKEL YANG BERKAITAN