Tehnik Kultur Sel dan Kultur Jaringan

Advertisement
Pengertian kultur sel adalah sel yang dapat hidup secara in vitro dan masih mempunyai sifat-sifat mirip dengan sel intak/sel asalnya, Lepas dari pengaruh sistemik, Sel-sel tertentu mengadakan proliferasi tetapi masih dalam keadaan tidak terdiferensiasi.

Kultur sel bukan suatu teknik baru. Merupakan metode untuk mempelajari perubahan fungsi sel/jaringan tanpa pengaruh sistemik. Mula-mula merupakan fragmen jaringan yang diletakkan di cawan kultur. kultu sel dimulai dengan menanam sel-sel embrionik. Kultur sel dapat dipakai untuk bermacam penelitian, misalnya antara lain antivitas intraseluler, intraseluler flux, ekologi sel, interaksi antar sel.

Beberapa kelebihan dan keuntungan penggunaan kultur sel meliputi :

  • Mudah dikontrol fisikokimia lingkungan (pH, suhu, tekanan oksigen, dan CO2) dapat dikontrol sesuai dengan keinginan
  • Mudah dibuat homogen sehingga mudah dianalisis
  • Ekonomis, tidak perlu memakai banyak hewan coba
  • Mudah diadakan perlakuan
  • Para peneliti ingin mendapatkan kultur sel berpopulasi homogen
  • Mudah diadakan intervensi,yang mudah dianalisis
  • Sel dapat tumbuh di cawan kultur
  • Penting sekali dengan yang dinamakan cawan/gelas tutup kultur

Kekurangan dan kerugian kultur sel antara lain:

  • Memerlukan keahlian, mempunyai peneliti yang sangat menyenangi kultur sel, selalu menjaga aseptis, tertip dan sabar
  • Gambaran histologis sudah tidak nampak
  • Tidak atau sukar untuk mengedentifikasi sifat-sifat seperti pada in vivo, misalkan akibat pengaruh sistemik
  • Mekanisme memulai kultur sel meliputi :
  • Mula-mula yang dipakai adalah fragmen jaringan, tidak hanya mendapat satu macam sel (populasi sel heterogen)

Sejarah penemuan kultur sel :
* 1885- Roux: sel embrio ayam dapat hidup diluar badan
* 1907- Harrison: menanam saraf spinal amfibi dan tumbuh sel saraf disekelilingnya
* 1910- Rous: membuat tumor dengan induksi ektrak tumor ayam , timbul virus RNA (Rous carcinoma virus)
* 1913- Carrel: dalam keadaan aseptik sel dapat hidup dengan baik
* 1948- Earle dtt.: menanam sel tunggal yang dapat hidup berkelompok
* 1952- Gey dkk.: menanam sel kanker serviks manusia, didiamkan, sekarang terkenal dengan nama sel turunan (cell line) HeLa cell line
* 1954- Levi-Montalcini dkk: dengan rangsangan NGF kultur saraf tumbuh dengan baik
* 1955- Eagle: menemukan nutrisi yang diperlukan oleh kultur sel. Nutrisi dicampur dengan protein dan dibuat dalam bentuk serbuk
* 1956- Puck dkk.: memisahkan sel-sel mutan HeLa dengan memberi makanan tertentu
* 1958- Temin & Rubin: mengukur secara kwantitatif kultur embrio ayam terinfeksi dengan Rousus sarcoma virus, diteruskan dengan virus yang lain
* 1961- Hayflick & Moorhead: kultur fibroblas manusia setelah membelah dalam jumlah tertentu akan mati
* 1964- Littlefield: mengenalkan media HAT untuk media kultur hibrid sel somatik. Kato mengadakan fusi sel pada tanaman
* 1965- Ham: mengenalkan serum free media untuk kultur sel mamalia
* 1968- Augusti-Tocco & Sato: neuroblastoma tikus ditanam dengan kultur sel saraf, memberikan elektrik (eksitabel)
* 1975- Kohler & Milstein: yang pertama membuat monoklonel-antibodi
* 1976- Sato dkk: pertama publikasi berseri tentang sel turunan yang berbeda memerlukan campuran hormon dan growth factor yang berbeda untuk tumbuh di dalam serum free medium

Macam_macam Kultur jalingan :
1. Eksplan, suatu irisan jaringan

sukar untuk dievaluasi, sel bertumpuk, tidak homogen, tidak dapat dihitung untuk analisisnya
yang dievaluasi adalah sel-sel yang tumbuh diluar irisan jaringan, yaitu dengan mengukur lebar pertumbuhan
untuk menanamnya ada cawan khusus
tidak perlu inkubator CO2, cawan ditutup rapat dengan tape supaya CO2 tidak keluar, dipakai untuk pernapasan

2. Kultur sel

Sel yang terpisah-pisah, sel mudah dihitung, sel dapat hidup satu lapis (monolayer)
Sel mudah dihitung baik sebelum dikultur maupun setelah dikultur (pada penyelesaian penelitiannya)
Harus memakai inkubator CO2 untuk campuran udara, digunakan untuk hidup
Kultur primer, setelah mendapat sel yang sudah terpisah-pisah langsung ditanam di dalam cawan kultur
Kultur sekunder atau subkultur setelah kultur primer konfluen dilepas dari cawan dan ditanam kembali dilain cawan kultur
Kultur primer maupun kultur sekunder dapat dipelihara sampai berhari-hari, contoh: fibroblas menghasilkan kolagen,otot skelet berkontraksi, sel saraf membuat sinaps.

3. Dispers sel:

Sebelum orang dapat mengadakan kultur sel, mereka hanya melumatkan jaringan dan menghitung selnya Tidak ditanam, hanya di dalam tabung, dan dimasukkan ke dalam inkubator CO2, setelah mendapat perlakuan dihitung lagi selnya. Dapat untuk menghitung atau mengukur konsentrasi substansia yang ada di dalam tabung yang dihasilkan oleh sel
Tidak dapat dievaluasi secara imunositokimia

Mekanisme Kerja Kultur Sel
Mengapa perlu mengadakan kultur sel, para peneliti terpaksa memakai kultur sel sebagai subyek penelitiannya:
Mudah dikendalikan pada suhu, tekanan osmotik dan pH
Mudah dibuat homogen
Mudah diadakan karakterisasi
Sel-sel yang dalam organnya hidup secara siklik 

Cara menanam kultur sel primer :
Kerjalah dengan aseptik dan teliti
Dipikirkan sel apa yang akan dikultur
Sel dipisah-pisahkan dari jarinan 
        –  Enzimatik: tripsin, kolagenase
        –  Mekanik: gojog-gojog dan vorteks bergantian
Disaring dengan saringan yang tidak perlu terlalu kecil. 
Dihitung selnya sebelum ditanam, sel ada di dalam media tanpa zat penumbuh. Dengan memakai hemositometer 
Kalau hemositometernya mempunyai 2 bilik, untuk rata-rata dapat menghitung ulang di bilik satunya. Jika hanya satu bilik, cuci dulu dan hitung lagi dengan suspensi baru 
 Evaluasi kultur sel :
Jika sel hidup, media jernih dan warna media agak menguning 
Jika sel mati, media makin jambu dan agak keruh 
Dengan melihat dibawah mikroskop inversi, kelihatan sel melekat di dasar cawan 
Jika sel mengapung di media setelah 24 jam, berarti sel mati 
      Tergantung pada desain penelitiannya
Sel sekresi, tetap mensekresikan sekret / hormon masuk ke dalam media 
Penelitian dihentikan pada waktunya, seperti pada desain 
Media dikumpulkan tiap cawan dalam satu tabung dan dikumpulkan sesuai dengan kelompoknya 
Setelah media terkumpul semuanya, dikerjakan penghitungan konsentrasi substansianya 
Evaluasi juga dapat dengan 
Menentukan kemampuan indeks proliferasi, dengan menghitung inti sel yang masih di dalam sel dibanding dengan yang ada diluar sel 
Menghitung jumlah inti, dengan membubuhkan timidin terlabel ke dalam cawan kultur, setelah kultur dicuci dengan bufer hangat. 
Didiamkan 24 jam dan kemudian sel dilepas dengan cangkul kultur dan dihitung b counter 
 Penanaman sel-sel tertentu perlu memakai matriks sel untuk pegangan sel, misalnya antara lain:
 Mioblas, 
Hepatosit, 
Endotel
Matriks sel merupakan larutan bubuk kolagen yang dilapiskan di atas cawan dan tunggu kering (buatlah 24 jam sebelum menanam).Kultur sel primer yang sangat mudah tumbuh adalah fibroblas, dalam 30 menit sudah menempel pada cawan kultur. Kalau menanam kultur dengan bermacam sel terutama ada fibroblas, setelah ditabur masukkan ke dalam inkubator dan tunggu 30 menit supaya semua fibroblas menempel. Keluarkan dari inkubator dan ambil media tanpa mengganggu dasar cawan, fibroblas ada didasar cawan, sel yang diinginkan ada di dalam media.

Jika menanam sel yang tercampur dengan eritrosit, pisahkan eritrosit dari sel-sel yang diinginkan dengan menambahkan EDTA. Ditunggu sebentar baru sel terpisah dari eritrosit. Subkultur, kalau kultur sudah konfluen (penuh di cawan kultur), sel dilepas dari cawan dengan memberikan 0,25% tripsin sambil cawan digoyang dan di bawah mikroskop, sehingga kalau sudah lepas kelihatan sel ikut goyang.

ARTIKEL YANG BERKAITAN