Metode Penelitian dengan Cara Blot : Western blot, Eastern Blot, Northern Blot dan Southern Blot



Blot adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi.

Keuntungan teknik blot adalah ;

a. Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau matriks. 

b. Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan. 

c. Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll dapat lebih singkat.

d. Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum dianalisis. 

e. Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode analisis yang dipakai 

Matriks Yang Di Gunakan Dalam Metode Blot 

Matriks yang biasa dipakai dapat berupa nitroselulosa (NC). Namun NC juga memiliki kekurangan, yaitu beberapa komponen yang memiliki afinitas lemah dapat hilang selama pemrosesan. Matriks lain yang dapat digunakan untuk menutupi kekurangannya yaitu kertas diazobenzyloxymethyl (DBM). Ada pula kertas lain, yaitu iazophenylthioeter (DPT).
Sumber: KLIK SINI 

Macam Macam Metode Blotting

1. Southern Blot
Southern blot pertama kali dikemukakan oleh Southern (1975). Teknik ini mentransfer DNA ke kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran pelarut. Caranya yaitu dengan menempatkan gel elektroforesis ke kertas matriks yang direndam buffer dan berada di atas sesuatu seperti spons yang telah dibasahi dengan buffer. Membran tersebut diletakkan di atas gel dan ditumpuk pula beberapa kertas peresap di atasnya. Buffer kemudian akan mengalir pelan-pelan ke membran, demikian pula dengan gel yang membawa molekul ke kertas membran, sementara gelnya diserap oleh kertas peresap. Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan pelacak. Pelacak biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida. Lokasi sinyal yang terlihat setelah autradiografi membuat kita dapat menentukan ukuran dari fragmen DNA tersebut. 

2. Northern Blot 
Northern Blot merupakan tekniknya sama dengan Southern Blot, namun menggunakan kertas DBM dan biasanya mendeteksi RNA.

3. Eastern Blot
Eastern Blot merupakan teknik yang ditemukan oleh Reinhard dan Malamud (1982), adalah proses transfer bidirectional dengan menggunakan aliran pelarut protein dari gel ke NC berdasarkan titik isoelektrik.

4. Western Blot
Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai western blot sebagai olok-olokan terhadap tekini southern blot yang pertama kali ditemukan.

Western blot merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan yang homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target.

Western blot dapat mendeteksi suatu protein dalam kombinasinya dengan sangat banyak protein lain, dapat memberikan informasi mengenai ukuran dan ekspresi protein tersebut. Sumber: KLIK SINI

Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran. Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Setelah pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian kromogen atau secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi primer dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di kamar gelap.

Langkah-langkah dalam Western Blot :

1) Menyiapkan sampel yang akan diteliti, apakah itu limfosit T atau fibroblas ataupun sel darah tepi. Sampel harus dijaga tetap dingin. 

2) Menyiapkan buffer agar pH dapat berada pada jangkauan yang stabil. 

3) Menyiapkan antibodi yang akan digunakan sebagai pelacak 

Monoklonal antibodi maupun poliklonal antibodi dapat digunakan 

a. Antibodi monoklonal adalah yang lebih baik digunakan, karena : 
• Sinyal yang lebih baik 
• Spesifisitas yang lebih tinggi 
• Hasil yang lebih jernih pada proses pembuatan film western blot 

b. Antibodi Poliklonal 
- Mengenali lebih banyak epitop 

4) Melisis Sel 

Kita perlu melisis sel untuk mengeluarkan protein yang diinginkan dari sel. Untuk melisis sel dapat digunakan detergen SDS dan RIPA. Bila yang diinginkan adalah sebuah protein yang terfosforilasi, maka perlu ditambahkan inhibitor fosfatase agar gugus fosfat pada protein tersebut tidak dibuang. Cara melisis : sentrifuge dan ambil pellet yang terbentuk. Jaga agar tetap dingin dengan menggunakan kotak es. Tambahkan buffer lisis, lalu kumpulkan dalam tabung eppendorf, jaga agar tetap dingin. 

5) Gel Elektroforesis 

Gel yang biasa dipakai misalnya SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis) untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dengan adanya arus listrik. Akrilamid 10% juga ditambahkan. Kerja SDS-PAGE ini adalah dengan mendenaturasi polipeptida setelah terlebih dahulu polipeptida tersebut dibuang struktur sekunder dan tersiernya. Sampel terlebih dahulu dimasukkan ke dalam sumur gel. Satu jalur biasanya untuk satumarker. Protein sampel akan memiliki muatan yang sama dengan SDS yang negatif sehingga bergerak menuju elektroda positif melalui jaring-jaring akrilamid. Protein yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat melewati jaring-jaring akrilamid. Perbedaan kecepatan pergerakan ini akan terlihat pada pita-pita yang tergambar pada tiap jalur. 

6) Transfer Gel 
Agar protein tersebut dapat diakses oleh antibodi, maka protein tersebut harus dipindahkan dari gel ke sebuah kertas membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF. Membran ini diletakkan di atas gel, dan tumpukan kertas penyerap diletakkan di atasnya. Larutan buffer kemudian akan merambat ke atas melalui reaksi kapiler dengan membawa protein-proteinnya. 

Cara lain untuk mentransfer protein adalah dengan menggunakan teknik elektroblotting. Teknik ini menggunakan arus listrik untuk menarik protein dari gel ke membran. 

Selain itu, diperlukan pula sebuah prosedur untuk mencegah terjadinya interaksi antara molekul-molekul yang tidak diinginkan agar hasil yang diperlukan lebih jernih (to reduce ‘noise’). Caranya adalah dengan menempatkan membran pada BSA (Bovine serum albumin) atau non-fat dry milk dengan sedikit detergen tween 20 sehingga serum tersebut akan menempel pada pada daerah yang tidak ditempeli protein sampel. Hal ini bertujuan untuk membuat antibodi hanya akan dapat menempel pada binding site protein target. Setelah itu, barulah membran dengan protein sampel tersebut diinkubasi dnegan antibodi. 

7) Deteksi
Deteksi dilakukan dengan antibodi yang telah dimodifikasi bersama dengan sebuah enzim yang disebut reporter enzyme. Proses deteksi biasanya berlangsung dalam dua tahap, yaitu :

a. Antibodi Primer
Antibodi yang digunakan di sini adalah antibodi yang pertama kali dihasilkan sistem imun ketika terpajan protein target. Antibodi terlarut kemudian diinkubasi bersama kertas membran paling sedikit selama 30 menit. 

b. Antibodi Sekunder 
Setelah diinkubasi bersama antibodi primer, kertas mebran dibilas terlebih dahulu barulah diinkubasi dengan antibodi sekunder. Antobodi sekunder adalah antobodi yang spesifik untuk suatu spesies pada antibodi primer. Misalnya, anti-tikus hanya akan berikatan pada antibodi primer yang berasal dari tikus. Antibodi sekunder biasanya berikatan dengan enzim reporter seperti alkaline fosfatase atau horseradish peroxidase. Antibodi sekunder ini kemudian akan menguatkan sinyal yang dihasilkan oleh antibodi primer. 

Sekarang, proses deteksi dapat dilakukan dengan satu langkah saja, yaitu dengan menggunakan antibodi yang dapat mengenali protein yang diinginkan sekaligus memiliki label yang mudah dideteksi

8) Analisis 
a. Colorimetric detection 
Metode ini digunakan bila substrat dapat bereaksi dengan reporter enzyme sehingga dapat mewarnai membran nitorselulosa 

b. Chemiluminescent 
Metode ini digunakan bila substrat merupakan molekul yang bila bereaksi dengan antibodi sekunder atu dengan reporter enzyme akan teriluminasi. Hasilnya kemudian diukur dengan densitometri untuk mengetahui jumlah protein yang terwarnai. Teknik terbarunya yang paking canggih disebut Enhanced Cheiluminescent (ECL). Teknik inilah yang paling banyak digunakan sekarang. 

c. Radioactive detection 
Metode ini menggunakan X-ray yang bila mengenai label akan menciptakan region gelap. Namun metode ini sangat maha dan beresiko tinggi terhadap kesehatan. 

d. Fluorescent detection 
Pelacak yang mmepunyai label yang dapat mengalami fluorosensi lalu kemudian dideteksi oleh fotosensor seperti kamera CCD yang menangkap image digital dari western blot. Hasil kemudian dapat dianalisi secara kuantitaif maupun kualitatif 

Metode ini juga merupakan salah satu metode yang paling sering digunakan karena sangat sensitif. 
Sumber: KLIK SINI 


Daftar Pustaka 
Andrews AT. Electrophoresis Theory, Techniques, Biochemical and Clinical Application. Clarendon press : Oxford ; 1986. 

Molecular Station. “Western Blot”. Available at : 

http://www.molecularstation.com/protein/western-blot/ (diakses pada 25 Maret 2008).

ARTIKEL YANG BERKAITAN